豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測相關知識
2021-08-05
熒光RT-PCR檢測試劑盒結(jié)果的判斷，最直觀的判斷是看放大曲線是否正常。 很多老師都受到異常放大曲線的困擾，我們結(jié)合幾個實例來看一下常見的異常放大曲線的分析，那么下面一起了解下豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測相關知識吧!
1. 熒光RT-PCR正常放大曲線
隨著實驗的進行，擴增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也相應增加。 每1個循環(huán)采集熒光信號，經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)(例如40個循環(huán))后，得到以下放大圖。 橫軸表示放大的循環(huán)數(shù)cycle，縱軸表示熒光的強度。
這還需要闡明以下基本概念。
基線：指在PCR放大反應的前幾個循環(huán)中，熒光信號變化不大。 接近一直線，其直線稱為基線。 明白這個就行了，對實驗操作影響不大。
閾值線：一般以前15個周期的熒光信號為熒光背景信號，閾值的設定為3-15個周期的熒光信號標準偏差的10倍，是PCR放大的指數(shù)期(圖中箭頭所示)。
2 .標準曲線
制作標準曲線有什么用，標準曲線可以用來決定未知樣本的初始量。 需要絕對定量時，需要標準曲線。
各模板的CT值和該模板最初拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關系，最初拷貝數(shù)越大，CT值越小。 標準品以一定倍數(shù)稀釋至5-6個濃度左右，根據(jù)RT-PCR的反應條件進行反應。 以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以CT值為縱坐標，繪制直線曲線。 未知樣本的拷貝數(shù)可以根據(jù)曲線方程計算。
3 .溶解曲線
簡言之，就是考察染料標記法結(jié)果的特異性。 更簡單地說，就是以分鐘為單位確認引物是否有效。
我不解釋復雜的原理。 關鍵看怎么看怎么判斷。 如果反應產(chǎn)物單一，曲線上會出現(xiàn)尖峰; 如果有二聚體和非特異性擴增，至少會出現(xiàn)兩個峰，或者進一步惡化。 采用SYBR Green染料必須繪制溶解曲線，但畢竟是非特異性染料。
在實驗中，大家還是會遇到很多問題。 讓我列舉幾個常見問題：
(1)放大曲線經(jīng)過40個循環(huán)后沒有平臺期? 還是放大曲線不會指數(shù)上升? 在這種情況下，你的初始模板濃度太低了，很可能經(jīng)過40個周期還沒有達到平臺期，可以通過增加周期數(shù)來驗證是否是這個問題。
(2)熔化曲線的問題，例如，有多個峰，或者尖峰尖有小峰，或者沒有峰? 因為這與引物及反應的體系溫度有關，所以如果沒有峰值，說是亂糟糟的很可能是引物的問題，所以建議重新設計引物。 在有小峰的情況下，可以通過優(yōu)化退火溫度的優(yōu)化等反應條件來消除這種影響。
以上介紹的就是豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測相關知識，如需了解更多，可隨時聯(lián)系我們!
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